تهیه گستره محیطی

تهيه گستره محيطي به روش دو اسلايدي(technic wedge Manual ) كه يك اسلايد به عنوان پخش كننده به كار مي رود

بسيار متداول است .

اسلايد پخش كننده بايد داراي لبه هاي بسيار صاف و عرض آن كمتر از اسلايد گستره باشد به نحوي كه حاشيه گستره

محيطي هم قابل مطالعه باشد.

 براي تهيه گستره به اين روش يك قطره 2-3 ميلي متري از نمونه خون كه به خوبي مخلوط شده باشد را

در انتهاي يك سانتي متري از اسلايد تميز و بدون گرد و خاك قرار داده و سپس لام پخش كننده را

در جلوي قطره خون قرار داده و به آرامي به عقب مي كشيم تا با قطره خون تماس پيدا كند و

اجازه مي دهيم تا خون در فاصله بين دو اسلايد پخش شود پس از آن با يك سرعت ثابت لام پخش كننده را

به سمت انتهاي ديگر لام حركت مي دهيم تا خون به خوبي پخش شود .

زاويه پخش كننده بايد30-45  درجه باشد ، البته براي افراد مبتلا به پلي سايتمي مي توان زاويه 25 درجه را

انتخاب كرد و در افراد كم خون زاويه را افزايش داد.

خصوصيات يك گستره محيطي خوب:

 – گستره خوني بايستي دو سوم تا سه چهارم طول اسلايد را بپوشاند.

 – حاشيه ها قابل مطالعه باشند .

 – گستره نازك ، يكنواخت ، بدون نامنظمي ، بدون حفره هوا و بدون خش Streak  باشد .

 – وقتي اسلايد در مقابل نور گرفته مي شود قسمت نازك اسلايد حالت رنگين كمان داشته باشد.

 – از تمام 2 -3 ميلي متر خون استفاده شده باشد.

 – گستره به تدريج از قسمت ضخيم به قسمت نازك برسد .

نكات مهم در تهيه گستره محيطي:

زمان ايده آل براي تهيه گستره محيطي و مطالعه مرفولوژي گلبول هاي سفيد و قرمز حداكثر تا

سه ساعت از نمونه گيري است، در حالي كه سنجش پارامترها و شمارش سلول هاي خوني

بشرطي كه نسبت صحيح ضد انعقاد به خون رعايت شده باشد تا 24 ساعت در يخچال 4 درجه داراي اعتبار است.

  نمك K2EDTA ضد انعقاد سفارش شده از سوي كميته استاندارد سازي در هماتولوژي به مقدار 0.25 ± 1/5

ميلي گرم به ازاي هر سي سي خون است.

  گستره شعله شمعي حاشيه هاي اسلايد را قابل مطالعه ميكروسكوپي مي كند و

با توجه به اينكه سلول هاي بزرگ و غير طبيعي غالبا در حاشيه هاي اسلايد قرار مي گيرند از اينرو

سفارش به تهيه اين نوع گستره گرديده و براي تهيه گستره اي كه حاشيه آن قابل مطالعه باشد،

كافي است كه لبه پخش كننده (spreader )را با قلم الماس قطع كنيد.

توجه داشته باشيد كه گستره بسيار نازك موجب پخش بسيار نامنظم گلبول هاي سفيد مي گردد.

بنابراين ضخامت گستره بايستي در حد متوسط باشد.

در هنگام تهيه گستره امكان دارد سلول هاي لوسمي يا غير طبيعي از نمونه خون توسط پخش كننده كه

خوب تميز نشده باشد به اسلايد بيمار ديگر منتقل شود.

از اينرو تعويض پخش كننده بعد از تهيه گستره نمونه غير طبيعي و يا تميز كردن آن با گاز مرطوب و خشك كردن

كامل آن براي هر بار استفاده سفارش مي شود.

براي ارزيابي گستره محيطي در بيماراني كه غلظت خون دارند و تهيه گستره مشكل است

مي توان يك قطره خون را با يك قطره آلبومين 5 %يا پلاسماي گروه AB مخلوط و سپس اسلايد را تهيه و رنگ آميزي كرد .

براي جلوگيري از اسماج شدن سلول ها نيز مي توان يكي دو قطره از آلبومين بانك خون به نمونه خون اضافه و سپس

گستره را تهيه كرد.

اضافه كردن آلبومين 5 %يا پلاسماي گروه AB به رسوب CSF نيز براي رنگ آميزي بهتر سلولها سفارش مي شود.

رنگ آميزي گستره:

براي رنگ آميزي از رنگ هاي رومانوفسكي مانند رايت و گيمسا استفاده مي شود .

اين رنگ ها از دو بخش قليايي و اسيدي تشكيل شده است .

رنگ هاي رايت ، گيمسا ، جنر ، مك نيل ، ليشمن و مي گرانوالد در خانواده رنگ هاي رومانوفسكي قرار دارند و هر

كدام داراي مزيت خاص خود مي باشند .

 براي مثال رنگ رايت براي آشكارسازي ساختارهاي سلول ، يك رنگ ايده آل و رنگ گيمسا براي رنگ آميزي انگل

مالاريا ايده آل است.

  گستره قبل از رنگ آميزي بايستي خشك شود .

از دميدن بر روي اسلايد به علت ايجاد رطوبت و توليد آرتيفكت آب خودداري كنيد .

پس از خشك شدن ، گستره را در عرض يك ساعت پس از تهيه با استفاده از يك رنگ رومانوفسكي حاوي

فيكساتيو ( رنگ رايت ) رنگ آميزي مي كنيم و يا اينكه گستره را در عرض يك ساعت بوسيله

متانول بدون آب ، فيكس كرده و براي رنگ آميزي توسط رنگ هاي فاقد فيكساتيو ( مانند رنگ گيمسا ) آماده

مي كنيم.

در رنگ آميزي ابتدا اسلايد به مدت 1-3 دقيقه با رنگ رايت پوشانده مي شود و سپس

هم حجم رنگ به آن بافر اضافه كرده و با دميدن ، رنگ و بافر را مخلوط كرده تا جلاي فلزي در سطح

گستره ظاهر گردد و سپس مخلوط رنگ و بافر را براي مدت 3 دقيقه ديگر نگاه داشته و

پس از آن اسلايد را با آب شستشو داده و پس از خشك شدن مورد مطالعه قرار مي دهيم.

خصوصيات يك اسلايد با رنگ آميزي خوب:

 – با چشم غير مسلح رنگ صورتي متمايل به بنفش كم رنگ دارد

 – گلبول هاي قرمز صورتي رنگ هستند و نه به رنگ قرمز يا ليمويي

 – هسته گلبول هاي سفيد بنفش ( ارغواني) و سيتوپلاسم نوتروفيل داراي گرانول هاي خرمايي است.

 – گرانول هاي ائوزينوفيل قرمز نارنجي و گرانول هاي بازوفيل بنفش تيره است .

 نكات مهم در رنگ آميزي گستره محيطي:

بهترين رنگ آميزي مربوط به نمونه هاي جديد است .

اسلايدهايي كه بيشتر از يك هفته مانده شده اند ، آبي رنگ مي گيرند .

قرار گرفتن اسلايد در برابر تابش نور خورشيد موجب پژمردگي رنگ مي شود.

رنگ آميزي گلبول هاي قرمز به صورت آبي تا سبز رنگ نشانه افزايش زمان رنگ آميزي يا قليايي بودن بافر است .

در اين حالت گرانول هاي نوتروفيل نيز برجسته و تيره شبيه به گرانول هاي توكسيك مي شود و

گرانول هاي ائوزينوفيل آبي يا خاكستري مي گردند .

كوتاه بودن زمان رنگ آميزي يا اسيدي بودن محيط رنگ آميزي يا اسيدي بودن بافر رنگ آميزي يا

اسيدي شدن رنگ به علت تبديل متانول به اسيد فرميك موجب كاهش كيفيت رنگ آميزي مي گردد .

گلبول هاي قرمز در اين حالت قرمز روشن يا نارنجي بوده و هسته گرانولوسيت ها آبي كم رنگ است ،

گرانول هاي ائوزينوفيل قرمز درخشان است .

چنانچه اسلايد قبل از خشك شدن با لامل پوشانده شود نيز ايجاد آرتيفكت صورتي در رنگ آميزي مي كند .

رنگ آميزي فوري اسلايد موجب جدا شدن قسمت ضخيم گستره از اسلايد مي شود .

براي نگه داري گستره محيطي رنگ نشده بايستي آن را با متانول فيكس نمود.

در غير اين صورت پروتئين هاي خشك شده در اسلايد كهنه موجب ايجاد زمينه آبي رنگ در رنگ آميزي شده و

ارزيابي گستره را دشوار ميكند.

  براي پاك كردن رسوب رنگ از سطح گستره مي توان آنرا براي چند ثانيه در متانول قرار داد و

سپس ارزيابي كرد، چنانچه رسوب مانع از ارزيابي گستره شود، گستره جديد تهيه كرده و يا

با متانول رنگ آن را كاملا پاك كرده و دوباره رنگ آميزي كنيد .

اسلايدهاي رنگ آميزي شده با رنگ رايت را مي توان رنگ زدايي كرد و براي يك رنگ ديگر مانند رنگ آميزي آهن در موارد ضروري استفاده كرد.

آرتيفكت هاي ناشي از آب و خشك كردن:

 – گلبول هاي قرمز با كناره هاي خورده شده ( شبيه خوردن موريانه )

 – حضور هاله مركزي واضح به علامت قرار گرفتن واكوئل در وسط گلبول قرمز به علت آرتيفكت آب

 – ايجاد مرفولوژي اكينوسيت در ناحيه اي از گستره كه ديرتر خشك شده باشد

 – هواي مرطوب ممكن است به گلبول هاي قرمز مرفولوژي اكينوسيت دهد براي جلوگيري از

رخ دادن آرتيفكت آب  (artifact  water )  بايستي از رنگ آميزي در هواي مرطوب و نمناك آزمايشگاه خودداري كرد.

گفتني است كه آلوده شدن الكل فيكساتيو يا رنگ به آب موجب ظاهر شدن واكوئل در

گلبول هاي قرمز شده و  چنانچه واكوئل ها در هاله مركزي قرار گيرند گزارش كاذب هيپوكروم داده مي شود.

اين مرفولوژي كاذب ناشي از آرتيكفت آب را توروسيت (torocyte) گو يند.

نکات مهم در کنترل کیفیت رنگ ها:

در ارتباط با کنترل کیفیت رنگ ها و محلول ها  توجه به چند نکته حائز اهمیت است

روزانه معرف ها را از نظر ظاهري بررسي كنيد.

1-  اگر رنگ رسوب كرده يا ته نشين شده، قبل از استفاده آن را صاف كنيد، حتي زماني كه معرف ها به صورت

تجاري خريداري مي شوند.

نكته: بعضي رنگ ها،  مي توانند آلوده شوند. در صورت شک به آلودگی ،  انجام رنگ آميزی با استفاده از معرف

تازه توصيه ميگردد .

2- تبخير شدن مواد ممكن است كارايي و تأثير معرف ها را دگرگون كند. اگر محلول هاي كاري با مصرف روزانه تمام

نمي شوند، بايد به طور منظم تعويض شوند

3-باز ماندن درب بطری رنگ باعث جذب دی اکسید کربن هوا  و کاهش کیفیت رنگ می شود بنابراین سعی شود

رنگ به صورت تازه تهیه و استفاده شود .

رنگ گیمسا و کلا رنگ های مورد استفاده در هماتولوژی در اثر ماندن خاصیت رنگ آمیزی آنها کاهش می یابد

چون در این رنگ ها متانول تبدیل به اسید فرمیک می شود و به واسطه همین تغییزات PH  اسیدی شده و

سلول ها به خوبی رنگ نمی گیرند و در رنگ آمیزی گیمسا بهترین کنترل کیفیت وجود کنتراست

بین رنگ قرمز کروماتین و رنگ ابی سیتوپلاسم است.

در رنگ آمیزی مالاریا رنگ گرفتن دانه های شوفنر در پلاسمودیوم ویواکس بهترین روش کنترل  کیفیت رنگ گیمسا

است .

توصيه مي شود كه محلول گيمسا از يك سازندة مطمئن فراهم شود.

حتي لازم است قبل از استفاده تعدادی  لام با رنگ مورد نظر  بررسي و آزمايش شوند تا در صورت دارا بودن کیفیت

مورد مصرف قرار گیرد.

براي تهية محلول رنگ آماده ، هنگام كار يك ميلي ليتر از محلول غليظ  را با 20 ميلي ليتر بافر یا آب ديونيزه رقيق

كنيد.

بهترین روش رنگ آمیزی این است که زمان در نظر گرفته شده متناسب با حجم رقیق سازی شده از رنگ باشد،

مثلا اگر محلول رنگ 20/1 رقیق شده، رنگ آمیزی برای مدت 20 دقیقه انجام شود و 30/1 به مدت 30 دقیقه.

استفاده از بافر با PH=7.2  برای رقیق کردن رنگ بخصوص رایت و رایت گیمسا مناسب تر است ولی رنگ گیمسا

را با آب مقطر نیز می توان رقیق کرد.

مقدار PH محلول را با افزايش مقادير كم از محلول   Na2HPO4 %2   تا 7.2 بالا ببريد و درصورت بالا بودن   pH

با افزايش مقاديري از محلول    KH2PO4 %2آن را پايين بياوريد تا به  pH 7/2برسد   اگر رنگ اسیدی با شد

باعث ایجاد زمینه صورتی و سلول های قرمز مایل به نارنجی دیده می شود و اگر

رنک قلیایی باشد سلول ها  به رنگ بنفش  دیده خواهند شد.

وقتي pH محلول به 7.2 رسيد، آن را در يك بطري بريزيد كه در آن محكم بسته شده است  (بهتر است از بطري تيره رنگ استفاده شود.)

سپس آن را در مكاني خنك و دور از نور مستقيم خورشيد نگهداري كنيد.

اين محلول براي مصرف چند هفته مناسب است. ولي لازم است تا چند هفته به طور منظم  كنترل شود تا

مطمئن شويد كپك روي آن رشد نكرده است. محلول را تكان دهيد و در صورت كدر شدن آن را دور بريزيد.

اگر درب بطری رنگ باز بماند به سبب جاذب الرطوبه بودن با جذب بخار موجود در هوا  و

تبخیر الکل موجود در آن باعث افت کیفیت شده و چند روز پس از  استفاده کیفیت رنگ کاهش پیدا می کند

مقدار مصرف باید برای هر مرحله مجزا   تهیه شود و به هیچ وجه از رنگ باقیمانده از مرحله قبل

برای رنگ آمیزی استفاده نشود  و نیز برای رقیق کردن بر روی  باقیمانده رنگ  قبل رقیق سازی انجام  نشود .