استاندارد عملکردی آزمایش تعیین حساسیت ضد میکروبی به روش انتشار از دیسک Disk Diffusion

Performance Standard for Antimicrobial Disk SusceptibilityTesting

این استاندارد  بر گرفته از دو استاندارد  CLSI M02-A10 و CLSI M100-S21 با هدف استاندارد سازی آزمایش تعیین حساسیت ضد میکروبی به روش انتشار از دیسک Disk Diffusion است و شامل کاربرد روش های استاندارد در سنجش حساسیت  به روش دیسک دیفیوژن و انجام آزمایش های تعیین حساسیت ضدمیکروبی و دستورالعمل های انتخاب دارو و دستورالعمل های پیشنهادی برای آزمایش و گزارش دهی روتین و انتخابی می پردازد .

طبقه بندی تفسیری آزمایش تعیین حساسیت ضد میکروبی :

نوعی طبقه بندی بر اساس پاسخ ارگانیسم در شرایط In vitro به سطوحی معادل سطح خونی یا بافتی حاصل از تجویز دوز معمول یک عامل ضد میکروبی است .

• حساس ( Susceptible )  : به گروهی از باکتری های جدا شده اطلاق می گردد که رشد آنها در برابر غلظت داروی ضد میکروبی ، بر اساس دوز توصیه شده مهار می گردد .
• حساسیت بینابینی ( Intermediate ) به گروهی از باکتری های جدا شده اطلاق می گردد که با سطح MIC بدست آمده در خون وبافت پاسخی پائین تر از باکتری های حساس می دهند
• مقاوم ( Resistant ) به گروهی از باکتری های جدا شده اطلاق می گردد که :
• رشد آنها با غلظت های معمول دارو و با دوز متداول مهار نشود
• هاله عدم رشد بدست آمده از آنها به علت مکانیسم های ویژه مقاومت میکروبی ( نظیر بتا لاکتاماز ) باید به صورت مقاوم گزارش گردد
• غیر حساس ( Non Susceptible ) یک نوع طبقه بندی برای ارگانیسم هایی است که فقط محدوده تفسیری حساس دارند اما محدوده تفسیری بینابینی و مقاوم ندارند

آزمایش D-Zone

یک آزمایش انتشار از دیسک است که در آن دیسک اریترومایسین و کلیندامایسین کنار هم قرار داده می شوند تا مقاومت القایی کلیندامایسین در استافیلوکوک ها و استرپتوکوک ها سنجیده شود .

دیسک های انتی بیوتیک:

این دیسک ها از کاغذهایی با کیفیت بالا و با غلظت مشخص از آنتی بیوتیک و به طور استاندارد تهیه شده اند دیسک های ذخیره باید در حرارت (-14 درجه سانتی گراد و دیسک های مصرفی در یخچال 2-8 درجه سانتی گراد نگهداری کنید.

نگهداری دیسک ها در حرارت بالاتر باعث افت قدرت دیسک ها شده و جواب مناسبی نخواهید گرفت.

– تهیه کدورت استاندارد:

برای تهیه کدورت استاندارد 0/5 میلی لیتر از محلول 1/175 درصد کلرور باریم با 2 مولکول آب را در یک بال ژوژه 100 میلی لیتری ریخته و با اسید سولفوریک 1% حجم را به صد میلی لیتری برسانید.

(آماده در دسترس است)

• محیط نیم مک فارلند

محیط نیم مک فارلند محیطی در تست آنتی بیوگرام  است که میزان کدر بودن نمونه خود را با ان مقایسه می کنیم . این محیط حاوی  ۱.۵*۱۰^۸ باکتری است .
این محیط به مدت ۶ ماه در تاریکی و در ظرف در بسته که به وسیله اتش بسته شده است می تواند مورد استفاده قرار گیرد . اما با این اوصاف ، اگر در هر زمان رسوبی در لوله مشاهده شد ، محیط غیر قابل استفاده خواهد بود . زمانی که می خواهیم از این محیط استفاده کنیم باید انرا به خوبی حل بزنیم و جهت مقایسه کدورت لوله کشت با لوله مک فارلند، استفاده از یک زمینه سفید با خطوط سیاه و نور کافی توصیه می‌شود این اقدام بویژه جهت باکتریهایی مثل هموفیلوس، گنوکک و پنوموکک که در محیط آبگوشت به خوبی رشد نمی‌کنند توصیه می‌شود

تهیه سوسپانسیون میکروبی:

به کمک سوآب از قله 3-4 کلنی میکروبی برداشت کرده و داخل یک لوله حاوی سرم فزیولوژی به صورت سوسپانسیون در آورده تا کدورتی به اندازه کدورت لوله استاندارد به دست آید.

اگر سوسپانسیون رقیق باشد قطر هاله عدم رشد بزرگ تر و اگر غلیظ تر از استاندارد باشد هاله عدم رشد کمتری خواهید گرفت(بدون این که حساسیت ارگانیسم تغییری کرده باشد)

بعد از کشت نمونه دریافتی در محیط کشت مناسب ، اگر شرایط مناسب باشد و باکتری در نمونه ما باشد ، باکتری موجود در نمونه رشد خواهد کرد . بعد از رشد باکتری ، از ان لام (مقداری نمونه + سرم فیزیولوژِی) تهیه می کنیم و رنگ آمیزی گرم انجام می دهیم . اگر باکتری ایزوله ما ، جز باکتری های پاتوژن باشد ، باید تست آنتی بیوگرام را انجام دهیم . مقداری از نمونه را برداشته و در محیط کشت آنتی بیوگرام کشت می دهیم ، سپس دیسک های آنتی بیوگرامی را روی محیط کشت گذاشته و جواب را بعد از ۲۴ ساعت برسی کرده و نتایج را گزارش می کنیم

اصول آنتی بیوگرام بر پایه دو اصطلاح میکروب شناسی است یعنی

• Minimum Inihibitory Concentration (MIC)
• Minimum Bactericidal Concentration (MBC )

منظور از MIC ، غلظتی از یک آنتی بیوتیک است که می تواند رشد باکتری را در شرایط آزمایشگاهی مهار کند. و منظور از MBC ، حداقل غلظتی از دارو است که باکتری را از بین می برد. در اغاز باید بگم که باید آزمایش کننده چهار اصل زیر را قبل از آغاز آنتی بیوگرام مشخص کند :

• Which organisms to test?   کدام ارگانیسم برای تست
•    What methods to use?کدام روش تست
• What antibiotics to test?   کدام آنتی بوتیک
•    How to report results? چگونگی گزارش نتایج

روش های مختلف انجام تست تعیین حساسیت داروئی

• Disk diffusion (Kirby Bauer)
• Broth micro-dilution MIC (CLSI)  متد رفرنس
• Etest

متن فارسی  2012- 21-CLSI-S

CLSI-S30 – 2020