مقدمه

سمپلر (یا میکروپیپت) یکی از ابزارهای اساسی و پرکاربرد در آزمایشگاه‌ها است که برای برداشت و انتقال حجم معینی از مایعات و محلول‌ها به کار می‌رود.

سمپلرها قادرند مقادیر بسیار دقیقی از مایعات را در محدوده میکرولیتر (معمولاً بین ۰.۲ تا ۱۰,۰۰۰ میکرولیتر) جابه‌جا کنند. سمپلر ها با توجه به مدل برداشت به انواع ثابت و متغیر دسته بندی می شود. سمپلرهای ثابت میزان معین و ثابتی را برداشت می کنند و سمپلرهای متغیر قابلیت تنظیم حجم های مختلف را دارند.

این ابزار مانند سایر تجهیزات آزمایشگاه نیاز به بررسی صحت و دقت کارکرد دارد. در امر کنترل کیفیت سمپر بیش از هر اقدامی ابتدا باید با استفاده از ابزار سرویس مربوطه مانند روغن، الکل سفید و میله بازکننده انسدادهای احتمالی، نسبت به سرویس سمپلر اقدام نمود. در صورت صحت ساختمان فیزیکی سمپلر، کنترل کیفیت انجام می پذیرد.

بررسی دقت و صحت سالی دو بار به روش های مختلف مانند رنگ سنجی با استفاده از رنگ سبز خوراکی و با پارانیتروفنل و یا روش توزین امکان پذیر است.

دسته بندی سمپلرها:

• گروه A : 100-1000 میکرولیتر
• گروه B : 10-100 میکرولیتر
• گروه C : کمتر از 10 میکرولیتر

ارزيابی سمپلر به روش رنگ سنجي:

در اين روش با استفاده از يك محلول رنگي با جذب پايدار، مثل رنگ سبز خوراكي در طول موج 630-620 نانومتر و يا پارانيتروفنل در طول موجهاي 401 يا 405 نانومتر ، صحت عملكرد سمپلر  و نيز قابليت تکرار آن كنترل مي شود.

مواد و ابزار مورد نياز :

• رنگ سبز خوراکی در آب
• پارانيتروفنل Paranitrophenol (C6H5NO3) PH(5.4-7.5)   در  هيدروکسيد سديم  01 . 0 نرمال
• لوازم شيشه ای کلاس A  با توجه به حجم مورد نياز در تهيه غلظت محلول رنگی(از قبيل بالن ژوژه و پيپت )
• فتومتر یا اسپکتروفتومتر دارای طول موجهای 401 يا 405 برای پارانيترو فنل  و 620يا 630 نانومتر برای رنگ سبز خوراکی
• نکته : طول موج انتخابي براي قرائت محلول پارانيتروفنل 401 نانومتر است ولي امكان قرائت در 405 نانومتر نيز وجود دارد.
• لوله آزمايش
• ترازو ( کاليبره و تحت کنترل )
• سر سمپلر مناسب

با توجه به دسته بندی سمپلر ها به سه گروه ( A, B, C )، برای هر گروه محلول رنگی ذخیره ( Stock) تهیه می شود.

نکته قابل توجه: از آنجايی که اغلب فتومترها بهترين عملکرد خود را در  محدوده جذبی 0.4  نشان ميدهند محلول های ذخيره رنگی با غلظتی تهيه می‌شوند که پس از مرحله رقيق شدن  دارای جذبی در محدوده 0.4 باشند.

تهيه محلول ذخيره رنگ سبز خوراكي:

• سمپلرهای گروه C (کمتر از 10 ميکروليتر) : 1.55 گرم (1550 ميليگرم) از پودر رنگ سبز در 100 ميلی ليتر آب مقطر حل شود. ( رقت 1001/1 )
• سمپلر های گروه B (10-100 میکرولیتر) : 155 میلی گرم در 100 میلی لیتر آب مقطر حل شود. ( رقت 1/101 )
• سمپلر های گروه A ( 100-1000 میکرولیتر): 15.5 میلی گرم در 100 میلی لیتر آب مقطر حل شود. (رقت 11/1 )

تهیه محلول ذخیر رنگ پارانیتروفنل:

• سمپلرهای گروه C ( سمپلرهای کمتر از 10 ميکروليتر) : 420 ميلي گرم پودر پارانيتروفنل ، در 100 ميلي ليتر سود 0.01 نرمال حل می‌شود. غلظت رنگ ذخيره اين گروه، 420ميلي گرم درصد است. ( رقت 1001/1 )
• سمپلر های گروه B (10-100 میکرولیتر):  42میلی گرم در 100 میلی لیتر درسود 0.01 نرمال حل شود. ( رقت 101/1 )
• سمپلر های گروه A ( 100-1000 میکرولیتر): 4.2 میلی گرم در 100 میلی لیتر سود 0.01 نرمال حل شود. ( رقت 11/1 )

همانطور که گفته شد انجام روش رنگ سنجی با استفاده از پودررنگ سبز خوراکی و نيز پارانيتروفنل امکان پذير است، لذا نحوه تهيه هردو محلول ذخيره  ذيل بيان شده است .

قابل ذکر است درسال‌های اخير رنگ سبز خوراکی بعضا بصورت ناهمگون و يا محلول عرضه شده که در اين موارد، دستورالعمل زير صادق نبوده و در اين شرايط بهتر است از پارانيترو فنل استفاده شود.

ارزيابی دقت:

برای بررسی دقت عملکرد سمپلر و به عبارتی سنجش مقدار عدم دقت يا قابليت تکرار، ابتدا محلول ذخيره رنگی مناسب طبق روش ذکرشده و باتوجه به حجم سمپلر مورد كنترل، تهيه می گردد سپس ده لوله در جالوله ای چيده و با استفاده از پي پت كلاس A  مقدار مشخص آب مقطردر صورت استفاده از رنگ سبز ويا سود 0.01 نرمال در صورت استفاده از پارانيتروفنل، با دقت بسيار زياد  در هر لوله ريخته مي شود.

سپس بااستفاده از سمپلر مورد كنترل ، از محلول ذخيره رنگي برداشت شده و به هر لوله اضافه مي شود .

پس از مخلوط كردن، ميزان جذب نوري لوله ها در مقابل آب مقطر (بلانک) قرائت مي گردد .

همانگونه که قبلا ذکر شد طول موج انتخابی برای قرائت جذب نوری رنگ سبز خوراکی 620 يا630  نانومتر وبرای پارانيتروفنل 401 يا405 نانومتر ميباشد.

به عبارت ساده تر برای بررسی دقت عملکرد سمپلر و به عبارتی سنجش مقدار عدم دقت يا قابليت تکرار پس از تهیه رنگ های ذخیره  این رنگ ها ابتدا با استفاده از بالن ژوژه کلاس A و پیپت کلاس A  رقت مناسب (مثلا برای سمپلر های گروه A  یک به صد رقیق می شود) و جذب نوری این رقت به عنوان Expected مورد انتظار در نظر گرفته می شود.

حال همین رقت ( یک به صد )  را در لوله برای تکرار پذیری ایجاد می کنیم یعنی ده لوله در جالوله ای چيده و با استفاده از پي پت كلاس A   مقدار مشخص آب مقطردر صورت استفاده از رنگ سبز ويا سود 0.01 نرمال در صورت استفاده از پارانيتروفنل، با دقت بسيار زياد  در هر لوله ريخته مي‌شود.

سپس بااستفاده از سمپلر مورد كنترل ، از محلول ذخيره رنگي برداشت شده و به هر لوله اضافه مي شود .

مثلا برای سمپلر 100 لاندا  در هر لوله 10 میلی لیتر آب مقطر و یک حجم با سمپلر 100 لاندا به این لوله ها رنگ ذخیره  اضافه می کنیم و این رقت یک به صد است که هر ده لوله به این صورت تهیه شده و مقدار جذب نوری هر کدام خوانده می شود که این جذب نوری به عنوان Observed   خواهد بود.

• برای ارزیابی تکرار پذیری برای خوانده های لوله ( 10 لوله ) مقدار CV محاسبه می شود که مقدار CV کمتر از 2% قابل قبول است.

ارزيابی صحت:

جهت كنترل صحت عملكرد سمپلر و تهيه معيار سنجش صحت در روش رنگ سنجی ، بايد محلولی با استفاده از ابزار شيشه ای کاليبره و دارای رقت مشابه رقت تهيه شده  توسط سمپلر تهيه شود (1001/1 يا 101/1  ويا 11 /1 )

بدين منظور با پي پت کلاس A، مقداري از محلول رنگي ذخيره (متناسب با  گروه حجمی سمپلر و طبق روش ذيل)، به بالن ژوژه کلاس A اي كه تا خط نشانه از آب مقطر پر شده اضافه ميشود.

روش تهيه محلولهای کنترل صحت :

كنترل صحت گروه C  ( سمپلرهای کمتر از 10 ميکروليتر ) رقت 1001/1:

بالن ژوژه يك ليتري برای سبز خوراكي با آب مقطر و برای پارانيتروفنل با سود 01/0 نرمال   به حجم رسانده و سپس1 ميلي ليتر از رنگ ذخيره(  گروه C ) به آن اضافه و مخلوط مي گردد.

كنترل صحت گروه B  (سمپلرهای 10-  100   )  رقت 101/1   :

بالن ژوژه 100 ميلي ليتري، برای سبز خوراكي با آب مقطر و برای پارانيتروفنل با سود 01/0 نرمال به حجم رسانده و سپس1ميلي ليتر از رنگ ذخيره (گروه B) به آن اضافه و مخلوط مي‌گردد.

كنترل صحت گروه A  (سمپلرهای بیشتر از 100 )  رقت 11/1  :

بالن ژوژه 100 ميلي ليتري برای سبز خوراكي با آب مقطر و برای پارانيتروفنل با سود 01/0 نرمال به حجم رسانده و سپس 10ميلي ليتر از رنگ ذخيره ( گروه A ) به آن اضافه و مخلوط مي‌گردد.

هرگاه  در بالای خط نشانه  برای اضافه کردن 10ميلي ليتر رنگ فضای خالی وجود نداشت ، تاجائيکه امکان دارد از حجم 10ميلی ليتر به بالن اضافه نموده و بقيه را به داخل بشر منتقل مي‌کنيم .

پس از مخلوط نمودن کامل محتويات بالن ژوژه ، همه حجم را به بشر اضافه نموده و با محتويات بشر ، بالن ژوژه را چند بار شستشو ميدهيم.

پس از اطمينان از يکنواختی  محلول صحت تهيه شده ، محلول حداقل در سه لوله ريخته و جذب نوری آن قرائت می‌شود  .

ميانگين خوانده ها بعنوان معيار مقايسه صحت دربررسی صحت عملکرد سمپلر استفاده ميشود .

شاخص صحت، تورش  (Bias) است که از فرمول زير بدست می آيد:

Expected  : ميانگين جذب نوري 3خوانده ازمحلول بالن ژوژه کلاس A

Observed : ميانگين جذب نوري 10 لوله که در مرحله عدم دقت بدست آمده است.

• به منظور به حداقل رساندن عوامل ايجاد خطا بهتر است بررسی دقت و صحت در يک روز انجام گيرد .

مقادير مجاز عدم دقت و عدم صحت :

بدنبال ارتقای فنآوری ابزار آزمايشگاهی و بهبود کيفيت عملکرد ابزار ، مقادير عدم صحت و عدم دقت ادعائی سازندگان ميکرو پيپت ها نيز بسيار کاهش يافته است . لذا اولين معيار مقايسه و بررسی کاليبراسيون سمپلر ها، ميزان ادعای سازندگان سمپلر برای (Inaccuracy Bias) و CV%  Imprecision) ) ميباشد  .

لازم به ذکر است معيارهای ياد شده که با توجه به تنوع سمپلرهای مورد استفاده آزمايشگاهها انتخاب شده است، اگرچه از معيارهای مجاز اعلام شده قبلی کوچکتر ميباشد ولی هنوز با ميزان قابل قبول برخی مراجع بين المللی  فاصله زيادی دارد.

توزین:

در کنترل کیفیت سمپلر به روش توزین، ارزیابی دقت و صحت سمپلر با استفاده از یک ترازوی آزمایشگاهی کالیبره با دقت 0.0001 یا چهار صفر و یا حداقل با تروزی سه صفر انجام می شود.

محدوده دمایی قابل قبول آزمایشگاه جهت کنترل کیفیت به این روش 15-30 درجه سانتی گراد است.

روش انجام:

تعدادی نوک سمپلر نو و مناسب، مقداری آب مقطر یک بار تقطیر و یک دماسنج کالیبره آماده کرده و به همراه ترازو و سمپلری که قرار است کنترل کیفیت روی آن انجام شود، را حداقل یک ساعت قبل از انجام آزمون آن ها را در کنار یکدیگر قرار دهید تا دمای همگی یکسان شود.

قبل از انجام آزمون ابتدا از صحت فنی سمپلر اطمینان حاصل کرده و سپس 5 بار با مقدار حجم نامی، نوک سمپلر را با آب مقطر آبکشی کنید.

ترتیب انجام کار:

1. در یک ظرف ترجیحاً درب دار مقدار کمی آب مقطر ریخته و روی صفحه ترازو قرار داده و ترازو را صفر کنید.
2. یک سر سمپلر نو و مناسب به سمپلر متصل کنید، سمپلر را در صورتی که حجم متغیر باشد، روی حجم نامی قرار دهید و به اندازه حجم نامی آب مقطر بکشید و در ظرفی که روی ترازو قرار دارد تخلیه کنید.
3. وزن خوانده شده از ترازو را ثبت کنید.
4. ترازو را صفر کنید و مراحل قبل را 9 بار تکرار کنید.
5. دمای آب مقطر را به وسیله دماسنج به دست آورده و ثبت کنید.
6. مقدار جرم میانگین 10 بار توزین را با استفاده از فرمول محاسبه کنید.

مقدار مورد انتظار با توجه به مقدار چگالی آب مقطر هر لیتر، یک کیلوگرام وزن دارد، بنابراین هر میکرولیتر آب مقطر برابر یک میلی گرم وزن خواهد داشت.

برای داده های به دست امده، مقدار میانگین، CV و SD را محاسبه نمایید و مقدار CV به دست آمده را با مقدار مجاز مقایسه کنید.

Observed : مقدار میانگین به دست آمده از توزین

Expected : حجم اسمی سمپلر

• در روش های ارزیابی بر پایه وزن سنجی، به دلیل متفاوت بودن مقدار جاذبه زمین در ارتفاع های مختلف به دلیل اختلاف فشار هوا و هم چنین تاثیر دما بر فشار، ضریب تصحیح باید اعمال شود و این ضریب بر اساس تغییر فشار هوا و دما متغیر است.

تعیین ضریب اصلاح بر اساس فشار و دما

تنظيم:

در صورت وجود Bias غيرقابل قبول برحسب نوع سمپلر در برخی از انواع سمپلرها (سمپلرهای ثابت ( Fixed Volume با مراجعه به راهنماي آن امکان تصحيح حجم وجود دارد.

در مورد تنظيم سمپلرهای متغير بايد توجه داشت که هرگونه تغيير در حجم‌های مختلف، به ميزان ثابت اعمال مي‌شود .

بدين معنی که تغيير 1 ميکروليتر در حجم 100ميکروليتر   (1% )، در حجم 10 ميکروليتر نيز، باعث همان اندازه تغييری يعني 1 ميکروليتر خواهد شد (  يعنی 10%  تغيير ).

لذا عمل تنظيم کاليبراسيون بهتر است توسط شرکت معتبر انجام شود.

نحوه نگهداري سمپلر:

كليه قسمت هاي خارجي اغلب سمپلرها را مي توان با محلول صابون تميز كرد و پس از آبكشي با آب مقطر در دماي اتاق خشك نمود.

براي ضدعفوني كردن ، محلول 60%  ايزوپروپانل توصيه مي شود. (انواعي نيز قابل اتوكلاوكردن هستند كه آنها را در اتوكلاو استريل مي نمايند) پس از شستشوي سطوح خارجي و تميزکردن بخش نگهدارنده نوك سمپلر “Tip holder” (كه به كمك ميله همراه يا با سوآپ آغشته به اتانل 70 درصد انجام مي گيرد) بايد پيستون با مقدار كمي از روغن همراه سمپلر،که اغلب Silicone grease است ، روغن كاري شود.

براي تميز كردن قسمتهاي داخلی سمپلر بايد به راهنماي همراه سمپلر مراجعه شود.

ايمني:

• ضربه به سمپلر مي تواند اين وسيله را از كاليبراسيون خارج نمايد.
• با انتخاب سر سمپلر مناسب، حجم محلول برداشتي بايد در حدي باشد كه مايع وارد قسمت‌هاي داخلي نشود.
• تماس دست با نوك سمپلر آلوده ممنوع است.
• در صورت مكش محلول هاي اسيدي و ساير مواد با خاصيت خورندگي بايد بخش نگهدارنده نوك سمپلر (Tip-holder) باز شده و پيستون و حلقه پلاستيكي (O-ring) بخوبي با آب مقطر شسته شود.
• هرگز نبايد سمپلر حاوي محلول به پهلو روي ميز گذاشته شود.
• هرگز نبايد سمپلرهاي متغير را بر روي حجمي خارج از محدوده حجم ادعائي آن تنظيم كرد.

منابع:

کتاب کنترل کیفیت ابزارهای پایه و تجهیزات روتین دکتر جباری (جلد اول)